Carlo Caporale
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RICERCA
a) Caratterizzazione strutturale e funzionale di proteine e geni di origine vegetale (9, 12, 13, 14, 17, 19, 21, 23, 26, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 46 dell' elenco Pubblicazioni in forma estesa) Proteine e geni coinvolti nei meccanismi di difesa della pianta: Le piante reagiscono allo stress ambientale (condizioni climatiche avverse, attacco di agenti patogeni, ferite meccaniche, etc.) difendendosi in diversi modi. Infatti, in seguito ad una offesa si ha una immediata reazione che prevede tra l'altro la sintesi di nuove proteine che sono state chiamate pathogenesis-related (PR) e sono state per la prima volta isolate dal tabacco infettato con virus TMV. Le PR-proteine sono state inizialmente classificate in 5 famiglie principali (da PR-1 a PR-5). Attualmente si conosce solo la funzione biologica delle PR-2, PR-3 e PR-5. Le PR-2 e le PR-3 sono rispettivamente dotate di attivita' β- 1,3-glucanasica ed attivita' chitinasica, le PR-5 hanno attivita' antifungina e sono strutturalmente omologhe all'inibitore bifunzionale α-amilasi/tripsina da mais ed alla taumatina, una proteina estratta dall'arbusto tropicale Taumatococcus danielli. La funzione biologica della famiglia PR-1 e' ancora completamente sconosciuta, mentre, solo di recente, e' stata trovata attivita' antifungina per una proteina da orzo appartenente alla famiglia PR-4. Scopo del lavoro condotto e' stata la caratterizzazione strutturale e funzionale di queste proteine nel frumento tenero. La tematica e' sicuramente di notevole interesse giacche' questo cereale e' di fondamentale importanza alimentare. I risultati fin qui conseguiti riguardano quattro proteine appartenenti alla famiglia PR-4 che sono state isolate dalla cariosside di Triticum aestivum cv. S. Pastore e denominate wheatwin1, 2, 3 e 4. Le proteine, che hanno un peso molecolare di 14 kDa, sono state completamente sequenziate, e due di esse clonate in E. coli ed espresse. Esse sono altamente omologhe e formate da una singola catena di 125 amminoacidi che presenta il residuo N-terminale bloccato da acido piroglutammico. Le proteine hanno un elevatissimo grado di identità (95%) con una omologa proteina (barwin) isolata da seme e da foglie di orzo e con proteine espresse da geni indotti da ferita nella patata (Solanum tuberosum) e nell'albero della gomma (Hevea brasiliensis). La proteina barwin é stata ritrovata in questi tessuti solo in seguito a ferite meccaniche inferte alle foglie e mostra una attività antifungina in vitro . Con la messa a punto di saggi di attività antifungina, si e' potuto verificare che le proteine wheatwins sono attive su vari funghi patogeni, ma in particolare su quelli specifici per il frumento. A tale scopo si sono utilizzati due tipi di funghi patogeni specifici: Fusarium culmorum (che specificamente inibisce la crescita della pianta attaccando il culmo) e Fusarium graminearum (che attacca la parte aerea della pianta); il patogeno ad ampio spettro d' azione utilizzato per confronto e' stato Botrytis cinerea. Recentemente e’ stata anche dimostrata la attivita’ ribonucleasica di queste molecole illustrandone il probabile meccanismo di azione mediante studi di computer modelling che hanno anche permesso di spiegare la diversa attivita’ biologica in relazione a microvariazioni della struttura tridimensionale. Si sono inoltre caratterizzate anche proteine PR appartenenti a classi diverse quali glucanasi, chitinasi e perossidasi. Inibitori di amilasi e proteasi: La frazione proteica idrosolubile del chicco di grano contiene potenti inibitori di proteasi e di amilasi endogene o di origine animale. In particolare gli inibitori di α-amilasi sono raggruppabili in famiglie di isoinibitori di differente peso molecolare. Sono distinguibili isoinibitori monomerici della famiglia di peso molecolare 13,000, dimerici della famiglia 26,000 e tetramerici della famiglia 50,000. Nell'ambito di ciascuna famiglia tali isoinibitori sono distinguibili a loro volta sulla base della diversa mobilita' elettroforetica a pH alcalino. Queste molecole sono da lungo tempo studiate in relazione al loro ruolo fisiologico di difesa antiparassitaria per le piante e per il possibile effetto antinutrizionale nei confronti di animali e dell' uomo. I risultati raggiunti si concretizzano nella determinazione della sequenza aminoacidica dell' isoinibitore di amilasi 0.39 appartenente alla famiglia 13,000 nonche' l'assegnazione dei cinque ponti disolfuro dell' isoinibitore 0.28 appartenente alla stessa famiglia. La conoscenza della struttura di queste proteine e' senz'altro fondamentale per la comprensione del rapporto tra struttura e funzione tra diversi isoinibitori di amilasi. Meno studiati, finora, sono gli inibitori di tripsina e chimotripsina pur presenti nel chicco di grano. Un primo risultato raggiunto e' stato quello di mettere a punto una generale procedura di purificazione che permette di ottenere in forma omogenea gli isoinibitori di amilasi delle famiglie precedentemente descritte, nonche' di alcuni inibitori di tripsina; uno di questi ultimi (denominato WTI) e' stato caratterizzato nelle sue proprieta' chimico-fisiche, determinata la struttura primaria e l' attività antifungina ed e' stato identificato il sito reattivo. Glutenine: Le subunita' gluteniniche ad alto peso molecolare (HMW-GS) costituiscono circa il 10% del totale delle proteine del frumento maturo. Esse sono prevalentemente presenti nei polimeri gluteninici di peso molecolare superiore a 106 daltons, anche se poco si sa della loro organizzazione in questi polimeri e, in particolare, della localizzazione dei ponti disolfuro. Le subunita' HMW sono codificate da geni ai loci Glu-1, situati sui bracci lunghi dei cromosomi 1A, 1B e 1D. Ognuno di questi loci complessi e' costituito da due geni strettamente associati che codificano per subunita' di tipo x, di peso molecolare circa 85000 daltons, e subunita' di tipo y, di peso molecolare circa 65000 daltons. Il principale interesse nello studio di queste molecole deriva dalle correlazioni esistenti tra la loro struttura e le qualita' panificatorie dei frumenti teneri. La distribuzione dei residui di cisteina determina la possibilita' di formazione di ponti disolfuro inter o intra molecolari, i quali sono di particolare importanza nel determinare le qualita' tecnologiche del glutine. Tutte le subunita' fino ad ora caratterizzate hanno un unico residuo di cisteina nella regione C-terminale, mentre nella zona N-terminale ne hanno, solitamente, tre quelle ti tipo x e cinque quelle di tipo y. Il lavoro effettuato e' consistito nella purificazione e caratterizzazione di alcune subunita'. La subunita' 1Dx2.2* e' caratterizzata dalla presenza di un dominio ripetuto interno molto piu' lungo rispetto a quello delle corrispondenti varianti alleliche, mentre le regioni N- e C-terminali rimangono costanti. L' interesse tecnologico per questa subunita' e' notevole poiche' il dominio ripetuto interno sembra fondamentale per le qualita' panificatorie. Inoltre, si e' determinata la sequenza N-terminale delle subunita' 20Bx e 20By, nonche' il numero e la posizione dei residui di cisteina della 20Bx. Questa subunita' presenta solo due cisteine, una nella regione N-terminale e l'altra nella regione C-terminale, a differenza delle altre subunita' di tipo Bx che ne hanno quattro. Poiche' i residui di cisteina sono fondamentali per la formazione dei polimeri gluteninici, la presenza di due sole cisteine dovrebbe portare a polimeri di dimensioni minori dotati di peggiori qualita' tecnologiche. b) Bioinformatica b1) Informatica ed ottimizzazione di moderne tecniche di analisi strutturale di proteine (15, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 28, 29, 34, 45, 47 dell'elenco Pubblicazioni in forma estesa) Allo scopo di ottimizzare l'uso dei sequenziatori automatici per la determinazione della struttura primaria di proteine in tempi molto brevi e con grande risparmio di materiale, sono stati disegnati ed implementati su personal computer tre diversi algoritmi che utilizzano dati di sequenza ottenuti da miscele di peptidi. I tre differenti metodi si differenziano sulla base della pregressa conoscenza della sequenza proteica da determinare. Infatti, tale sequenza puo' essere completamente sconosciuta, conosciuta solo parzialmente, oppure altamente omologa a quella di una proteina di riferimento. Inoltre, i dati di sequenza possono essere combinati o meno con dati di spettrometria di massa ottenuti sulle stesse miscele. Il vantaggio di questo tipo di approccio sperimentale e' evidente. Infatti, la strategia classica per la determinazione della sequenza di una proteina prevede che la molecola sia frammentata in peptidi di diversa lunghezza con almeno due differenti metodi di idrolisi e che tutti i peptidi vengano purificati e sequenziati per ottenere, tramite le zone comuni, l' allineamento della sequenza. Sequenziando direttamente le miscele di peptidi si evita la loro purificazione e si effettuano solo tante analisi quante sono le miscele. L' applicazione di questi metodi ha portato alla determinazione della struttura primaria di diverse proteine. Inoltre, e' stato disegnato un altro algoritmo che, sulla base della conoscenza della sequenza amminoacidica, determina il pattern di idrolisi di un polipeptide idrolizzato con uno o piu' agenti idrolitici. L' algoritmo utilizza i dati di sequenza delle derivanti miscele di digestione. Un approccio del genere e' utile sia per ottenere rapidamente informazioni sulla struttura tridimensionale di una proteina in soluzione, sia per determinare la natura e la specificita' degli agenti idrolitici, se questi sono sconosciuti. Le applicazioni del metodo hanno portato alla rapida caratterizzazione della attivita' proteasiche presenti nell'intestino di un insetto parassita delle piante e nei brodi di cultura di un fungo ligninolitico, alla identificazione dei siti di proteolisi dell' ormone cromogranina A che generano il peptide catestatina inibitore del rilascio di catecolammine, ed ad ottenere, congiuntamente all’ applicazione del modelling molecolare, informazioni sulla struttura tridimensionale di diverse proteine. Infine, e' stato messo a punto su personal computer un programma per la localizzazione dei ponti disolfuro di proteine. I dati sperimentali utilizzati sono quelli ottenuti mediante analisi di spettrometria di massa delle miscele peptidiche derivanti dall'idrolisi della proteina nativa. Il programma identifica, sulla base della sequenza nota della proteina, tutte le strutture di frammenti peptidici uniti da uno o piu' ponti disolfuro il cui peso molecolare corrisponde ai dati sperimentali ottenuti mediante l'analisi spettrometrica. Il programma tiene anche conto di eventuali informazioni sulla specificita' degli agenti usati, al fine di eliminare dall'output complessivo quelle strutture incompatibili con tale specificita'. Molto recentemente il programma e’ stato riscritto per poter lavorare sulla intera banca dati NREF-PIR allo scopo di fornire informazioni sulla localizzazione dei ponti disolfuro delle proteine in essa contenute. Pertanto, il prof. Caporale ha scritto su invito dell' editore della rivista internazionale "Journal of Peptide Research" un articolo di "review" su argomenti riguardanti l'utilizzo di algoritmi computerizzati per la rapida caratterizzazione strutturale e funzionale di proteine mediante dati ottenuti dalla ottimizzazione ed interazione delle moderne tecniche analitiche. b2) Informatica e banche dati (10 e 11 dell'elenco Pubblicazioni in forma estesa) L' utilizzo del personal computer nelle ricerche in campo biochimico va progressivamente progredendo fino a far diventare questo strumento indispensabile sia per lo svolgimento di operazioni complesse e routinarie, sia per la gestione di banche dati di sequenze di proteine ed acidi nucleici. I risultati ottenuti in questo campo si concretizzano nella messa a punto di una serie di algoritmi per la gestione di un data base di sequenze di proteine. Gli algoritmi piu' significativi riguardano tutte quelle operazioni che hanno a che fare con il calcolo e la grafica di un parametro strutturale di un qualunque aminoacido lungo una sequenza proteica (ad esempio idrofilicita') e le relative differenze di questo parametro tra due o piu' sequenze proteiche; inoltre, l' identificazione di zone di omologia fra sequenze o anche la ricerca di una particolare composizione aminoacidica o del peso molecolare di un frammento lungo una sequenza allo scopo di trovare eventuali differenze tra proteine omologhe; infine, un potente algoritmo (SCAN) che permette di cercare molto velocemente una qualunque sequenza contro tutto il data base allo scopo di poter classificare nuove proteine. A tal proposito, l' organizzazione di un data base contenente circa 20000 sequenze di proteine in famiglie strettamente correlate si' e' rivelata estremamente efficace. c) Caratterizzazione strutturale e funzionale di idrolasi dell' orletto a spazzola intestinale (3, 4, 5, 6, 7 dell'elenco Pubblicazioni in forma estesa). Questa tematica, sviluppata ad inizio carriera, e' di notevole interesse in quanto un deficit di questi enzimi e' stato collegato alla celiachia, malattia dell' infanzia caratterizzata da una intolleranza al glutine. Scopo del lavoro e' stata la caratterizzazione strutturale e funzionale di queste proteine. Lo studio condotto si e' svolto focalizzando l'attenzione sia sulle analogie e differenze che questi enzimi presentano nelle forme fetale ed adulta, sia sull' azione che essi svolgono su substrati naturali quali le beta caseomorfine, peptidi dotati di azione morfino-simile derivanti dalla beta caseina del latte. Come fonte di enzimi fetali facilmente accessibile e' stato usato il meconio emesso da neonati nelle prime ventiquattro ore di vita; come fonte di enzimi adulti sono stati usati sia prelievi bioptici intestinali che intere parti di intestino provenienti da donatori d'organo. Gli studi condotti su enzimi grezzi hanno portato ad una prima indicazione sulle differenze nella composizione di carboidrati di queste glicoproteine nelle forme fetale ed adulta, differenze non attribuibili a diversi contenuti di acido sialico. Questi risultati sono successivamente stati confermati utilizzando enzimi purificati ad omogeneita'; in particolare, sono state purificate e caratterizzate dal punto di vista cinetico e strutturale due Aminopeptidasi N da meconio umano unitamente ad una Dipeptidilpeptidasi IV dalla stessa fonte e la Aminopeptidasi N da intestino di uomo adulto. Si e' inoltre dimostrato, utilizzando sia l'orletto a spazzola intestinale in toto che la dipeptidilpeptidasi precedentemente menzionata, che il peptide caseomorfina derivante dalla caseina del latte viene rapidamente digerito in vitro ed e' stato quindi possibile ipotizzare che esso raggiunge i propri recettori sotto forma di un precursore (procaseomorfina) che non viene invece idrolizzato. d) Tematiche minori (1, 2, 8, 27 dell' elenco Pubblicazioni in forma estesa). Il primo risultato raggiunto in gioventu’ e' consistito nella purificazione e caratterizzazione di una α-amilasi prodotta da un batterio termoacidofilo, le cui peculiarita' sono molto interessanti anche in virtu' delle possibili applicazioni biotecnologiche. L' enzima studiato, prodotto dal Bacillus acidocaldarius che vive nelle pozze caldo-acide della Solfatara di Napoli, ha un optimum di attivita' a pH 3.5 alla temperatura di 75 gradi centigradi ed e', naturalmente, assai stabile ad alte temperature. Il tema della termofilia ha in seguito avuto un grandissimo sviluppo, come dimostra la crescente letteratura in merito. Altro risultato raggiunto e' stata la purificazione e caratterizzazione di una proteina estratta da timo di vitello attiva sul metabolismo dei lipidi. Questa molecola aumenta la capacita' di legame della lipoproteina umana LDL sia sui fibroblasti umani della pelle sia su una speciale linea di cellule epatiche del ratto. Le potenziali applicazioni farmacologiche di codesta proteina sono senz' altro notevoli. Infine vanno menzionati lavori riguardanti la caratterizzazione funzionale e strutturale di una laccasi fungina e la messa a punto di un metodo gas cromatografico combinato con Spettrometria di massa per la determinazione dell' acido idrossistearico estratto dalle feci.
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